簡析RNA幹擾技術類八戒影院

RNA幹擾技術（RNA interference，以下簡（jiǎn）稱RNAi）是一種高度（dù）保守的基因沉默機製，由小分子RNA介（jiè）導，通過（guò）基因序列特異性方式降（jiàng）解信（xìn）使RNA（mRNA）或抑製其翻譯。自1998年（nián）美國科學家Fire和Mello在線蟲中發現RNAi現象並因此獲得2006年（nián）諾貝爾生（shēng）理學或（huò）醫學獎以來，該技術（shù）已成為基因功能研究、藥物開（kāi）發和農業生物技術的重要工具，特（tè）別是隨著轉基因玉（yù）米品種DvSnf7 dsRNA（商品名為SmartStax PRO）的成功（gōng）商品化，RNAi八戒影院的研發（fā）成為農業病蟲害防治的熱點（diǎn）。本文簡要介紹了（le）RNAi八戒影院的作用機製、關鍵技（jì）術控製點，以及與化學八戒影院的區別，希望能為國內相關工作提供參（cān）考。

1 定義與作用（yòng）機製（zhì）

RNAi是生物（wù）體（tǐ）內天然（rán）的基因沉默（mò）機製，廣泛存在於植（zhí）物、動物（wù）、真菌等真核生物中，其核心功（gōng）能是調控基因表達和防禦外源核酸（如病毒）的入侵（qīn）。RNAi八戒影院就是利用該（gāi）沉默機製設計的（de）一種核酸藥物，通過遞送外（wài）源基因（yīn）分（fèn）子進入害蟲或（huò）病原體細胞內，沉默或（huò）幹擾目標生物的靶標基因（需要被沉默的（de）內（nèi）源基因），阻斷特定蛋白的（de）合成，從而抑（yì）製其生（shēng）長或繁殖。

2 構成與類別

RNAi農（nóng）藥發（fā）揮功效（xiào）需要將外源基因分子（zǐ）送入目標生（shēng）物體內，因此它的物理構成可以簡單地概念化為“外源基因分子+遞（dì）送載體”。

2.1 外源基因分子 它是RNAi八戒影院的活性成分，是人工設計的核酸分子，用於沉默（mò）靶標基因。能夠觸發RNA幹（gàn）擾的RNA分子有多種類型，雙鏈RNA（dsRNA）、小幹擾RNA（siRNA ）、短發夾（shRNA）為主要類型，其中dsRNA目前已在農（nóng）藥領域有成功的應用案例。如美國已商（shāng）品化的轉基因玉米品種（zhǒng）DvSnf7 dsRNA（商品名（míng）為SmartStax PRO）的分子類型也是dsRNA，其通用名中的“Dv”是目標害蟲（chóng）（Diabrotica virgifera）的學名縮寫，“Snf7”是目標（biāo）害蟲（chóng）被沉默的靶標基因（yīn）（Vacuolar protein sorting-associated protein 7）的標準名稱，“dsRNA”是（shì）外源基因分子類型。同時OECD也已發布針（zhēn）對dsRNA分子類型（xíng）農（nóng）藥的環境和膳食風險評估指導文件，（表1）。

表（biǎo）1 RNAi 3種（zhǒng）分子（zǐ）類型的區別

2.2 遞送載體（tǐ） 它是用於保護、運輸並增強外源基因分子進入目標生物細胞內（nèi）的（de）傳遞係統。遞送載（zǎi）體（tǐ）的材料主要有化學（xué）載體和生物載體兩類（lèi）。化學載體的材質主要有（yǒu）脂質體、聚合物或（huò）無機納米顆粒等。生物（wù）載體主要有工程微生物（wù）載體（tǐ）、病毒樣顆粒和轉基因生物載體等。轉基因玉米（mǐ）品種DvSnf7 dsRNA使用的就是轉基因生物載體。

3 關鍵技術控（kòng）製（zhì）點（diǎn）

RNAi農（nóng）藥的研發涉及多個技術環（huán）節，但主要是通過靶標基因分析、外（wài）源基因（yīn）設計和遞送係統優化等3個相互關聯的技術閉環（huán），實現其能夠精（jīng）準沉默目標害蟲的特定基因，同時不影響非目標生物（如益蟲、作物（wù）或哺乳動物）的特異性目標。

3.1 靶標基因的分析 作為靶標基因需要同時具備必需性、開放性（xìng）和高異源性。必需性是指被選基因（yīn）必（bì）須是目標生物存活（huó）必需（xū）的基因，受幹擾就會致（zhì）死（sǐ）。開放性是必須靶向mRNA開放區域，避免折疊區，以提升RNA誘導沉默複合體（RISC複合體）結合率。異源性是指不同物種間基因序列的差異程度。作（zuò）為靶標基因必須是（shì）目（mù）標生物特有或高保守的基（jī）因靶點，且在（zài）同種群中基因序列（liè）高度同源，與非（fēi）靶標生物的同源基因差（chà）異顯著。已商品（pǐn）化的（de）轉基（jī）因（yīn）玉米（mǐ）品種DvSnf7 dsRNA中靶標（biāo）基因Snf7，與同種群鞘翅目昆蟲98%同源，但與哺乳（rǔ）動物（wù）基因連續匹配僅9 nt。

3.2 外源基因設（shè）計 外源基因是誘導靶標基因沉默的工（gōng）具，決定這個工具效率的核心要（yào）素是互補性與異源性。互補性指外（wài）源基因與（yǔ）靶標mRNA在堿基（jī）序列上的配對匹配程度。匹配度是確（què）保基因沉默效率和特異性的核心指標，不同分子類型（xíng）的匹配要求稍有差（chà）異，但在種子區和切割位（wèi）點等核心區通常要求（qiú）絕對匹配。非核心區允許有限錯配，短鏈的siRNA的可容忍1～2個錯配，長鏈的dsRNA允許≤5%錯配。外源基因的異源性是要保（bǎo）證（zhèng）人工設（shè）計（jì）的外源基因與非靶標生物基因的序列有顯著差異，以確保僅靶向目標生物特定（dìng）基因，不會（huì）影響其他基因，且不會沉（chén）默非目標物種（如哺乳動物、傳粉昆蟲等）。目（mù）前，EPA要求與非靶基因連（lián）續匹配≤11 nt，EFSA要（yào）求（qiú）全基因（yīn）組相似性＜50%。已商品化的DvSnf7 dsRNA，它（tā）的外源基因分子（zǐ）與蜜蜂基因最（zuì）長（zhǎng）連（lián）續匹配僅9 nt。

3.3 遞送係統的（de）優化 遞送係統（tǒng）功（gōng）能（néng）是確保能將外源基因分子（zǐ）精準（zhǔn）送達害蟲或病原體細胞內，核心（xīn）要素是環境穩定性、屏障突（tū）破和可控（kòng）釋放。環境穩定（dìng）性目前是通過核（hé）酸修（xiū）飾和紫外防護（hù）等措施，延長外源基因分子在植物體內和土壤中半衰期（qī），以及提高在高溫環（huán）境下（xià）的活性。屏障突破是通過納米尺寸控製、添加表麵活性劑等措施，保證外源基因分子能（néng）突破害蟲或病原體體壁或腸（cháng）壁等多重生物屏障。可（kě）控（kòng）釋放是通過時間、空間（jiān）和劑量等3個維度，控製外（wài）源基因在目標生物體內的精準釋放，以確保外源基因分子濃度僅夠沉默靶基因，不會影響低親和力的非靶標基因。

4 與化學八戒影院風險管控的差異

RNAi八戒影院因其特異性，決定了它與化學八戒影院在防治範圍和風險評估側重點上（shàng）有（yǒu）較大區別。

4.1 防治範圍 較之化學八戒影院對（duì）農業病蟲害較寬泛的“化學幹預（yù）”特點，RNAi八戒影院具（jù）有精準的（de）“信息幹預”特點，因此它在防治範圍上不（bú）具備化學八戒影院那樣跨目級的（de）廣譜（pǔ）防治功能。其原因，一是受基因靶點保（bǎo）守（shǒu）性的限製，如不同目級的昆蟲（如鞘翅目與鱗翅目）同源基因序列（liè）差異都比較大，單一外源基因分子難以同時有效，即使同（tóng）目級，不同科/屬的昆蟲同源基因也存在顯著差異。實現有限範圍的多靶點，是當下研究的熱點。二（èr）是受遞送係統的限製。不（bú）同害蟲或病原體的體壁結構或細胞壁結（jié）構都存在差異，目前同一載（zǎi）體在（zài）跨種群高效遞送（sòng）方麵存在技術瓶頸。

4.2 風險評估 RNAi八戒影院風險評估（gū）技（jì）術（shù）原理與化學農（nóng）藥基本（běn）一（yī）致（zhì），也需從危害識別、暴露評估等環節評估其對（duì）生態環境、人體健康的風險，它與化學八戒影院最大的區別在於需要同時評價外源基因分子和遞送係統，重點是遞（dì）送係統的毒性和脫靶效應。

4.2.1 活性成分（外源基（jī）因分子） 主要評價靶標基因特異性、環境歸趨和健康風險，確保對非靶標基因（哺乳動物、傳粉昆蟲等）無交叉活性，降解物的（de）生態（tài）風險和通過食物鏈傳遞（dì）的風險可接受。

4.2.2 遞送載體 雖然遞送載體（tǐ）在RNAi八戒影院中有點類似化學八戒影院的助劑，但在功能上與化學助劑存在本質區別（bié），（表2）。

表2 遞送載體（tǐ）與常規八戒影院助劑的區別

在OECD和EPA的相關（guān）規定中對載體材料（liào）本身的毒性評估是風險評估的重點。評估的主要內容包括：載（zǎi）體材料本身的毒（dú）性、環境行為與歸趨、生態毒性、載體-外源基因分子複（fù）合物特（tè）性等。如是生物載體，需要（yào）評估生物載體的潛在毒性，包括評估載體是否引發宿主的免疫反應等（děng）。

5 結束語

RNAi八戒影院通過精準調控基因表達，在農業綠色防控上（shàng）展現出較（jiào）大的潛力，但（dàn）在遞送效率和脫靶效應等方麵仍麵臨挑戰。隨著相關技術的進步（bù），或將成為化學八戒影院的重要補充手段。